PCR实验室从设计到运营的设计方案搭建

当中国疫情防控工作取得明显成效时，境外疫情爆发增长的态势却仍在持续，导致我国外防输入压力加大，国内防范疫情反弹的复杂性也在不断上升。

为了贯彻落实疫情防控常态化工作中“外防输入、内防反弹”的工作要求，进一步加强医疗机构感染防控的各项措施，进一步加强医疗机构感染防控工作的各项措施，巩固疫情防控常态化形势下的“外防输入、内防反弹”工作要求。

在核酸检测能力方面强调“各地应加强医疗机构实验室设计建设，对所有三级医院以及县医院进行建设，使其能迅速达到新冠病毒核酸检测的条件；对其他二级以上医院也应同时加强建设，使所有三级医院都以及县医院的建设为目标，使其尽快达到新冠病毒核酸检测的条件。

一、场地要求和实验设计

根据《医疗机构管理条例》、《医疗机构临床实验室管理办法》、《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》、《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》等文件的规定，参照文件。

通常将PCR实验室划分为四个区，一是试剂准备区，二是样品制备区，三是PCR扩增区，四区为产物分析区。

为了避免交叉污染，进入各个工作区域必须严格沿一个单一的方向进行，即只能从试剂贮存与准备区→标本制备→扩增反应混合物配制和扩增反应区→产物分析区。在实验区域间，应采用传送窗将试剂和样品传送。目前，市场上绝大多数新冠病毒检测试剂盒都是在荧光定量PCR平台上研制出来的，所以没有产物分析区域也不会影响检测，60-80平方米的面积就可以满足要求，但其他如基于一代测序与基因芯片的检测项目就无法开展。

在整个PCR试验中，每一个单独的试验区都设有缓冲区，同时各区通过空气压力调节使试剂和标本在整个PCR试验过程中免受气溶胶的污染，并减少扩增产物对人与环境的污染。

实验区域、缓冲区顶部及传送窗内均设有紫外线灯，用于消毒。实验台的局部消毒是在试剂准备区、样品制备区设置一盏移动紫外灯。

用机械连结的不锈钢传送窗口传送试剂和标本，确保试剂、标本在运送时不会受到污染。

地板建议使用PVC卷材地面或自流平地，整体性好，便于清扫，耐腐蚀。无条件的也可采用水磨石地面，或大块瓷砖，瓷砖间接缝需小于2mm。

药剂制备区域

试验区主要进行的操作是：贮存试剂的准备、试剂的分装、主反应混合液的制备。

标本制作用的试剂和材料必须直接运到区内，不能通过其他区域。所需试剂的原料须储存于本区内，并在本区内配制成所需储存试剂。

在试剂配制区，设有2~8°C的冰箱和-80°C冷冻室，在计算冷负荷时需要将其计算在内。

宜控制房间面积15~20㎡为宜。本区域的压力梯度要求为：相对正压状态，防止外部空气进入含核酸气溶胶，造成污染。

样品准备区

在这一地区主要进行的操作包括临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)的提取、储存以及添加到扩增反应管中cDNA的合成。

试样准备区域设有2~8°C的冰箱和-20°C冷冻室，在计算冷负荷时要将其计算在内。样品制备区域需配备生物安全柜，以便对样品进行核酸提取。

为了避免提取的核酸在柜中反复循环，造成样本间的交叉污染，并产生假阳性结果，配备的生物安全柜必须为B2型。生保室的垂直气流全部来自实验室，经高效过滤器过滤后的排风直接排放到室外，不得返回安全柜和实验室。

按照经验，如果在实验室配备生物安全柜，每配备一台，实验室的面积将增加10平方米；标本制备区的面积宜在25~30平方米之间。该区域的压力梯度要求为：对邻近区域的正压力，以避免邻近地区进入本区的空气污染。

扩展区域

本区操作以DNA或cDNA扩增为主。另外，该区还可以将制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样品制备区)的加入以及主反应混合液(试剂贮存和准备区)制备成反应混合液。

巢式PCR法测定时，通常轮扩增后要打开反应管，因此巢式扩增具有较高的污染风险，所以要在该区域进行二次采样。

PCR实验室主要配置PCR核心仪器PCR仪，为了保证PCR仪器的正常工作，需要在实验室建设过程中配置专用UPS电源。该区域的面积控制在15-20㎡之间。该地区的压力梯度要求为：在本地区相对于相邻区域为负压，避免本地区气溶胶泄漏。在本地区，应尽量减少因气溶胶引起的污染而不必要的走动。单个操作如加样等应在超净台内完成。推荐采用大于10Pa的压差，控制上比较容易实现。

产品分析区域

在这一地区主要进行的是扩增片段的测定。如果用全自动封闭分析仪器检测，这个区域可以不设。

内部配有通风柜，保证室内相对负压，空气从室外流入室内。这一区域的面积控制在15m²~20m²之间。

该地区是扩增产物污染的主要来源，因此对于该地区的压力梯度要求为：与邻近地区相比为负压，以避免扩增产物从该地区扩散到其他地区。推荐采用大于10Pa的压差，控制上比较容易实现。

二、PCR实验室污染防治技术研究

PCR实验室设计核心是如何防止污染。实践中，污染主要表现为：扩增产物的污染、天然基因组DNA的污染、试剂污染和标本间的污染。因为当污染发生时，实验必须停止，直到找到污染源为止，并且结果必须无效，需要重新进行实验。因此出现污染后再围绕实验室寻找污染源不仅费时又麻烦，浪费人力物力。所以要避免污染，首先应该是预防，而非排除。

严格划分工作范围

(1)各实验区域设置合理；

(2)个别试验区域应清楚地标示(例如：醒目的门牌或不同的地面颜色等)，以免在不同的实验区域内设备物品、试剂等发生混淆。

系统设置合理

(1)空调通风系统的合理设置，尽量采用全送全排空调系统；

(2)严格控制气流压力，以保证试验区不同压力要求。

标准操作

(1)临床基因扩增检验实验室的技术人员必须接受入门培训，并获得合格的临床基因扩增试验；

(2)在进行试验时，操作人员必须戴手套，经常更换。另外，在操作中使用一次性帽子也是一种有效的防止污染的措施；

(3)清洁及时、正确。这个地区在试验工作之后，必须立即进行清理。对部分实验设备，除常规消毒液表面进行消毒消毒或紫外线灯照射消毒外，还应对部分实验设备进行高压消毒。

严密管理

(1)严格控制人员进出实验室。本试验无关人员不得随意出入实验室，有条件时，应设置独立通道，并设置进出整个实验区的门；

(2)工作人员离开时，在各实验区域使用有明显区分标志的工作服(如有不同颜色)，不能将工作服带到其他区域；

(3)尽量减少实验区内不必要的走动，以减少交叉污染的可能性。

(4)产物分析区是主要的扩增产物污染源，不能在实验室中倾倒废液，必须用消毒液浸泡消毒后，在远离实验室的地方将其丢弃，吸头等一次性材料也应通过消毒液浸泡消毒后统一处理，如焚烧等；

(5)扩增产物分析区可能使用某些可导致基因突变和有毒物质，对实验人员的安全保护应给予特别关注。

三、实验室配套设施齐全

要保证实验工作顺利进行，必须配备完善的配套设备和仪器，如超净工作台、离心机、进样器等，要根据每个实验室的实验内容配备相应的设备和仪器。

本表格所列仪器为满足新冠病毒检测的配置要求，空调排风系统等不包括在内。

四、PCR实验室质量控制

为了获得高质量的检测结果，制定严格的实验室管理制度至关重要。

依据实验室具体情况，编制并编制质量体系文件，并严格执行“质量手册”、“程序文件”、“操作指导书”。

其特点是要有明确的目标、规范的管理、有效的约束、高效率的和自我调节的机制。要求如下：

1、建立完善的SOP文件，规定质量活动的完成方法，每个SOP应对一个或一组相互关系的活动进行描述。

2、每一SOP文件应说明该项质量每一环节的输入、转换和输出所需的文件、材料、人员、记录及其与有关活动的接口关系。

明确每一环节转换过程中各要素的要求，即由谁做、做什么、完成什么程序、达到什么要求、如何控制、形成什么记录和报告，以及相应的审批手续。

4、对在质量活动中需要注意的特殊情况或特殊情况作出规定。操作流程应简洁、清晰、易于理解，员工熟练并严格遵守。

5、尽量减少在实验区域内不必要的走动，以降低交叉感染的可能性。产物分析区是扩增产物污染的主要来源，必须在远离实验室的地方用消毒液浸泡过的废液将其丢弃，用过的一次性材料也要用消毒液浸泡后进行统一处理。

6、在使用某些有毒物质时，应特别注意对实验者的安全保护。要保证实验工作顺利进行，必须完善配套设施。

五、员工配备

为了保证实验室的正常运转，需要1名副职称以上的检验技术人员和2名中级职称以上的检验技术人员，目前对新冠病毒检测能力的需求非常迫切，但一个高质量PCR实验室的建设也不是在朝夕之间完成。