遗传学检验间质评及分子实验室建设

基因检测作为近两年才兴起的一个新兴行业，特别是基因检测在医学临床中越来越多的应用，使得临床分子诊断质量问题日益突出，成为人们关注的焦点。当前临床应用中，存在着同一实验室J建设、不同检验批次间或不同实验室对同一标本检验结果的差异，这已成为困扰临床医生、病人和实验室技术人员的普遍难题。

各国对于基因测试的监管也越来越严格。因为基因检测的企业基本上都是由生物学家创造的，他们的实践者也大多是生物学专家，过去可能更注重技术而不重视质量。但是随着基因检测实验室融入到医学检验体系中，越来越多的基因检测项目有了全国性的质量评估活动，基因检测企业在关注技术发展的同时，对实验室质量体系的建设也越来越重视。遗传工程企业要发展，必须将技术与规范同等重视，才能有更多的发展机会。

卫生计生委六年十一月临床检验中心发布了2016年全国肿瘤游离DNA(ctDNA)基因突变室间质量评估调查活动结果报告。

PT成绩100分的实验室(不分先后排序)

化验室整体PT成绩统计分析

NGS的满分率仅为39.5%，通过率为79%，各种方法综合得分占50%，合格率为82%。由于临床质量要求还有提高的需要和空间，同一位病人的肿瘤基因检测如果各式各样的结果不同，会使临床医生以及患者对基因检测产生怀疑，因此追求的目标已经是所有基因检测实验室必须要提高的目标。

分子生物学实验室的建立和质量控制

一、设计临床分子实验室。

临床分子实验室建设必须确保基因检测质量，确保生物安全，在布局、设置、使用、管理等方面均符合《临床基因诊断实验室管理暂行规定》、《临床基因诊断实验室工作规范》、《临床基因诊断实验室工作规范》、《临床基因诊断实验室基本设置标准》及“微生物和生物安全通用标准”要求。

实验室建设设计的核心是防污染，应具有简洁的外观、合理的结构布局、标准的风向设置和严密的防护措施等。

该设计由试剂预备区、标本配制区、PCR扩增区、分析区4个独立的实验区，分别有缓冲装置及3个系统(单向气流系统、单向物品传送系统、生物安全控制系统)。

1.建筑布局设计。

其主体结构采用轻质砖墙(玻化砖贴面)与钢化玻璃等材料隔开，顶面采用轻质材料建造，设有总缓冲走廊、试剂配制区、标本处理区、PCR扩增、分析区4个独立的实验区。每个实验区域设有缓冲区，配备更多的衣柜和洗手池，便于清洁消毒。

(1)试剂配制区，该区域是制备实验试剂的场所。按PCR反应体系：常用30μl,50μl，各种成分的实际用量按实验者选择的该成分的终浓度和所拥有的储备液浓度计算。

(2)标本处理区，是实验中接收和处理标本的地方，主要是对临床标本的保存、核酸(DNA、RNA)的提取、纯化、储存以及RNA的逆转录操作。

(3)PCR扩增区，理论上讲，循环20~25次就可使PCR产物达到值，而在实际操作中，由于每步反应的收率不可能达到，所以无论模板浓度如何，都是比较合理的循环次数。周期数越多，非特异性扩增越大。

(4)分析区域，分析结果的地点，合并后可通过LIS发布报告功能。

人、物进出各实验操作区都有各自独立的通道，实验操作区域之间的试剂和模板通过带有紫外线消毒功能的传递窗单向传递。设计合理的结构布局，实现了临床分子实验室的分区要求。

每个操作区的吊顶均设置了集中风系统，使各操作区域的相对缓冲区形成相对负压，使各室内空气在集中排风管道中单向流动。设室转移窗可使样品模板和试剂单向流动。

2.实验室空气流量控制。

为了避免各试验区之间的交叉污染，宜采用全送或全排的气流形式，同时应严格控制送、排风比例，以保证各试验区的压力要求。在标本污染控制和生物安全防护要求的基础上，实验室设计在每个实验操作区域设置全排单向气流控制系统。

本系统由吸顶排风机、专用排风管和楼顶风机组成，根据每个操作区域面积大小，设置不同的排风机，力求各区域气压平衡，所形成的气流是缓冲总走廊空气流向各缓冲区域，各缓冲区域空气在各实验操作区域内流动。

通风系统工作时，各实验操作区域气体经排风机和风管外排，相对于每个缓冲区和总缓冲区为负压状态，实现各区域气流的单向流动。

3.项目在区域间进行单向传送。

PCR扩增区和样品制备区之间设置有紫外灯的机械连结不锈钢传递窗，分别用于试剂、样品模板等的单向传送。

在PCR扩增区配置的试剂通过传递窗单向传送到PCR扩增区，处理后的标本模板经单向传送至PCR扩增区，在超净工作台上进行加样，然后上机扩增。

注：PCR扩展区内的物品不会进入其他单独的区域。

二、生物安全控制的临床分子实验室。

1.二级生物安全柜。

如采用ThermoA2型生物安全柜，其内部清洁等级可达100级。该过滤器的过滤效率为330CFM(每分钟流量单位1CFM=28.3185L/min)，过滤效率为99.999%，过滤效率大于99.999%，能有效防止气溶胶对标本的污染及对人、环境的危害。

2.完善消毒系统和单向气流控制系统。

(1)4个实验操作区和每个缓冲区安装紫外灯、生物安全柜、超净台内及传送窗内紫外线灯，符合卫生部《WS/T367医疗机构消毒技术规范》的具体要求。

每个实验操作区额外配置移动紫外线消毒车1台，并局部补充消毒，需要定期对紫外线灯管进行清洁，每半年对其进行一次强度检测，如不符合标准立即更换。

(2)实现各实验操作区域的相对负压状态及气流单向流动，确保各实验操作区空气无相互流通。

3.单向传递和废弃物品在各操作区域之间。

(1)试剂和标本通过各自的专用传递窗单向传递到扩增区。各实验操作区人员固定，操作服、鞋帽、口罩手套、仪器设备、实验设备单独配置，防止跨区域使用。

(2)每个实验操作区域的所有废弃物，包括剩余标本、废液、废耗材和反应物，经0.5%过氧乙酸溶液浸泡消毒后，通过各自的路径送出。经高压蒸汽后，由医院有关规定统一收集处理，确保环境安全。

建立全面的实验室质量管理体系:

质量管理体系是实验室质量政策目标、组织结构、设施环境、仪器设备、试剂耗材、人员权利职责、操作程序、管理程序、质量保证、信息系统、文件控制、结果报告、咨询服务、投诉处理、纠正和改进的统一整体。质量体系的完善直接关系到患者和送检医生对分子病理实验室检测结果报告的可信度和满意度。因此，包括管理文件、程序文件和操作指导书(SOP)在内的质量体系文件必须传达给所有相关人员，以确保相关人员充分理解和执行这些文件。更重要的是，要控制日常检测工作流程的全过程质量，保证检测结果的准确客观。

①检质量保证：

除了实验者熟悉SOP文件外，环境设施和仪器试剂必须符合质量要求；分子病理检测对象通常是核酸，样品的预处理包括采集、处理和保存是否得当尤为重要。如果手术标本离体后要及时取材，用pH值为7.2~7.4的4%中性缓冲甲醛固定，固定液的用量一般是标本体积的10倍，固定时间取决于标本的大小，一般为6-48h，避免因固定时间不足或过长而影响组织结构完整性或破坏组织抗原，造成FISH等实验结果不理想，淋巴瘤基因重排检测所用的骨髓、血样必须用EDTA抗凝，4℃保存；人乳头状瘤病毒(HPV)检测的宫颈脱落细胞样本一经采集，应尽快送检，一般室温保存不超过12h，4℃保存不超过7d，-20℃保存不超过3个月。再比如RT-PCR室验对样品的要求是，新鲜组织必须尽快去除RNA酶或冷冻液氮，以防止RNA降解导致检测失败。检验前必须仔细核对检验申请表中填写的信息，接收样品后必须由接收人签字确认，以确保其编号与送检样品编号一致。

②检验质量保证：

实验室应根据检测项目的原理、适用范围、检测灵敏度、准确性、特异性和重复性，确认检测方法，无论是采用国际或标准发布的方法，还是权威技术组织指定的方法，还是使用自己新设计开发的非标准方法，还是扩展优化修改的标准方法。通过与其他方法的比较获得客观数据，验证检测方法合适可行，检测结果准确可靠。比如以指导靶向用药为主要目的的肿瘤基因突变检测，如果采用常规PCRSanger直接测序法作为本实验室的检测方法，可以与具有相同检测目的的的即时荧光定量PCR方法进行比较，以获取预期结果的一致性和检测限度等信息。再比如实验室引进了一套全自动原位杂交染色系统，用于HER2基因的常规检测，指导临床靶向用药。与手动操作模式相比，同一检测项目在设备、试剂和操作程序上发生了很大变化。实验室作为一个新的检测平台，应制定相关的方法验证程序，按照相应的仪器操作规程和检测项目的标准操作程序，从设备性能、试剂质量和检测过程等方面验证HER2基因检测结果的可比性，加强实验室的室内质量控制，使每个分子病理检测都有相应的标准操作程序，每个仪器设备的运行、维护和校准都是按照规定的程序操作的。每次检测都必须有质量控制对照，如阳性对照、阴性对照等。此外，还应参与实验室质量比较计划，即做好室内质量评价，可由卫生部病理质量控制评价中心、各省市临床病理质量控制中心、临床检查中心等外部质量评价机构组织，也可通过与其他实验室交换样品进行。如果评价结果达不到控制标准，实验室管理层应及时参与纠正措施的实施。实验室应记录这些室间的质量评价结果，并形成文件保存。

③检验后的质量保证：

获得检测结果后，授权分子病理学家将进行分析和审核，并发布结果。DNA、白片等实验后剩余样本可按规定继续保存，以备重复实验。不再用于检测的样品应按实验室废弃物处理程序处理。

④发放结果报告:

分子病理医生应在规定时间内以规范的格式发布分子病理检测报告。当检测结果因特殊情况未能及时获得并可能影响患者的诊断或时，可以通过发送延迟报告的方式通知医生，并及时采取纠正措施，尽快发布终报告。对于检测项目的临床意义、检测结果的判断原则、检测样本的注意事项和检测结果的适当说明，检测医生或患者在咨询时应耐心沟通。定期收集临床科室对实验室日常工作和检测结果的建议和要求，提出改进措施，确保每个工作流程都在质量控制范围内。

实验室除了满足临床检验中心的质量要求外，还应按照ISO15189规范进行管理和运行，积极申请ISO15189认证:

①ISO15189是什么？

国际标准化组织(ISO)于2003年2月15日正式由国际标准化组织(ISO)于2003年2月15日正式发布，分别于2007年和2012年进行了修订。目前使用的版本是ISO15189:2012。

该标准是基于ISO9000系列标准和ISO/IEC17025:2005。ISO15189从文件名中可以看出，它强调两个主题，即质量和能力。

质量是每个实验室生存的基础。保证质量的前提是建立完善的质量管理体系，并严格按照它们来实施。支持质量的因素是能力，包括管理能力和技术能力。

目前，中国认可医学实验室ISO15189的权威机构是中国认可委员会(CNAS)。现在CNAS已经将ISO15189:2012翻译成中文，重新命名为CNAS-CL02:2012《医学实验室质量和能力认可准则》。

②目前通过ISO15189认证的医学实验室有几个。

截至2016年4月30日，我国已有209个实验室通过ISO15189认证。有167所医院检验科、2所医院核医学科、1所医院病理科、2个血液中心、38个独立实验室。ISO15189标准体系认证的省份是上海，共有34个，国内个通过ISO15189认证的实验室是中国人民解放军总医院临床检验科。

③为什么医学实验室需要ISO15189认可？

提高医学实验室的质量和水平。按照ISO15189的要求，建立了质量管理体系，结合PDCA循环思想，不断完善工作流程，提高工作效率。

提高员工素质。经过规范的培训、人员的考核、体系文件的学习，能大大提高实验室人员的服务意识和专业技能。让每个人知道为什么要这样做，怎样有意识地这样做，这样做有什么好处。

提高社会认知度和市场竞争力。ISO15189作为国际标准，通过其认可，也间接地证明了实验室管理水平已达到国际标准，从而进一步证明医院的医疗质量是很高的，因而必然吸引大量病人来院就诊，提高医院的经济效益和市场竞争力。

避免医疗纠纷。按照ISO15189标准，实验室建立了一套完整、规范的质量体系，严格按照程序文件规范操作，对所有记录和实验数据进行有效管理。当患者提出疑问或要求时，确保有足够的证据。

与国际接轨，促进国际贸易。促进实验室检测结果的国际互认，通过与国际、地区、国外认可机构签订多边或双边互认协议，促进对外贸易。

三、ISO15189建立质量体系的时机。

筹备期，时间1-2个月

1.决定：

科室的质量管理体系应建立在实验室主任(管理部门)之上。

2.有关文件：

全国认可委网站下载相关文件，例如：

CNAS-CL02:2012医学实验室质量与能力认可指南

CNAS-CL02:2012医学实验室质量与能力认可指南

CNAS-CL05:2009实验室生物安全认可指南

CNAS-CL43:2012《临床血液学检验领域应用指南》

CNAS-CL42:2012《临床微生物学检测领域应用指南》

CNAS-CL41:2012《体液学检测领域应用指南》

CNAS-CL39:2012《临床免疫学定性检测领域应用指南》

CNAS-CL38:2012《临床化学检查领域应用指南》

分子诊断领域应用指南CNAS-CL36:2012

CNAS-CL35:2012《实验室信息系统应用指南》

3.行动委员会：

在实验室召开全体会议，科室成立ISO15189质量体系宣贯工作。

4.学习：

通过学习ISO15189相关文件，使其更好地掌握文件的相关内容。

5.文件编制和注意事项：

化验室负责人安排相关人员，按照文件的版本要求，编制科室文件，如：

①品质手册。

②计划文件。

③临床应用手册。

④安全手册。

5.1根据目前的2012版规定编写。

5.2文件基于2012版，并与实验室本身的操作编写。

5.3部门文件与标准文件中所列条款一致。

说明：规章将认证指南转换为实验室。

6.审阅文件：

写完文件后，组织相关人员一起对内容进行核对修改，确保质量手册、程序文件符合要求。

7.组织结构：

实验室主任，质量负责人，技术主管，安全主管，仪器管理员，试剂管理员，信息管理员，资料管理员，安全管理员等。

注：实验室建设组织结构清晰。

初步实施阶段，时间2-3个月

1.根据有关规定，各专业小组使用批表格(科一级表格)：

①记录温度和湿度。

②记录冰箱(恒温箱)。

③样品移交记录。

④样品不合格的记录。

⑤急症标本登记和报告记录。

⑥危险值报告记录。

⑦仪器维护记录。

关于生物安全的相关记录。

……

2.根据CNAS-CL02:2012《医学实验室质量和能力认可指南》以及各领域的应用说明编写一个与专业小组有关的文件：

①专业团队管理文档。

②仪器SOP。

③项目管理程序。

④业绩确认。

⑤各专业小组表格。

注：SOP条款必须符合ISO15189:2012中所列的条款。

3.进入第二批表格：

相应的实验表格和专业分组表格。

4.内部审查：

负责部门内审员和特邀人员(无证件的相关人员)对文件进行审核，确保程序文件和质量手册的符合性，对不合格项目进行文件的修改和归档。

5.报告项目：

ISO15189申报项目必须符合下列要求。

①参加卫生部室间质量评定。

其次是大肠杆菌。

③绩效检验。

注：报告的项目不要一意孤行，考虑第二年增加。

6.管理审查：

经过管理评审，调整管理系统，进入下一阶段。

6个月的正式执行阶段

1.文件按规定发放，组织人员学习文件，并按表格规定填写。

2.各专业小组按照适用于各专业小组领域的说明和科室文件规定，全面开展质量体系工作：

①室内质量控制。

②室间质评。

③绩效评估。

④人员比对。

⑤仪器比对。

……

注：(全部保留原始数据)

3.仪器和试剂管理：

①仪器档案(三证、验收记录、仪器简历等)

②建立供应商名单。

③测量仪器的实验室检验。

④评估合格的供应商。

⑤制定实验仪器清单。

⑥试剂验收。

⑦试剂入库；

剂型供货商清单。

……

4.人员培训：

严格按照ISO15189:2012文件要求进行人员培训，要求进行培训计划、培训实施、考核评价等。

注：(全部保留原始数据)

5.内部审查(执行审计文件的有效性)，管理评审。

注：(保留内审、管理评审原始材料)

6.自我检查：

严按《ISO15189申报评审核查表》自查、整改、记录每次自查结果。

报告、批准阶段

①申报阶段(提交信息3个月后)

1.1填写阶段：

在网上整理文件、下载《申请表》，严格按照表格规定填写，上报项目要填写：中间精密度、重复性精密度、准确度等，填写的内容必须与测定一致。

注：保留所有原始数据，未完成性能验证不考虑报告。

1.2授权接受阶段：

认可委员会是否接受，文件受理后，这一阶段需3个月(体系完全符合)，认可委审核文件的符合性、全面性，如有问题，将退回进行修改。

1.3认可委员会通过后：

告知实验室派评审专家，并在此时提出意见。

②现场评审阶段。

2.1确认委员会向专家组发送文件：

审查员将阅读文件，如文件符合要求，同意现场评审。

2.2现场评审等级：

按照所报的专业，派相关评审专家进行审核，时间一般为3-4天，会议是专家组组长主持，实验室主任用10分钟时间汇报质量体系情况，会后现场评审，组长由实验室主任陪同，并由实验室主任陪同。

2.3现场测试：

通常在评审前一周，专家小组人员与实验室联系，准备现场检测样品。依据实验室进行的项目、仪器、人员的建立比较方案，并按要求完成。

2.4实地审查(抽问)期间的评估：

注册签章(必考)、试剂管理员、数据管理员、仪器管理员等。

2.5实地检查之后：

化验室协助专家组填写检验报告。

注：质量体系建立通过认证后，制度要坚持，形成流程规范，一年后要进行15189监督评审，除了资料填写不同，其它流程也是一样的。两年一次的复审，一般要在复审期间增加报告项目。

Tips：认可委规定，在下列情况下，申请表将被视为实验室存在诚信问题：

a.所提供的申请资料相互矛盾，或不符合实际，如申请并不具备的能力。

b.管理体系文件有明显的复制痕迹，例如，体系文件中所述实验室没有从事或不存在实验室的活动。

c.不同实验室提供的相关记录相同，或同一实验室在不同时间提供的质量记录(例如内部审查、管理评审记录)内容相同。

d.化验室质量记录中的笔迹、内容及其他明显的作假痕迹。

e.对实验室申请资料真实性产生怀疑的其他情况。

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